重组单抗药物的肽图分析_生物学_自然科学_专业资料。生物 杖 术 通 报 ? 研 究报告 ? 丑了 百 口 厅 口乙口 年增刊 重 组 单 抗 药 物 的肤 图 分 析 魏敬双 程立均 刘进怀 , 贾茜 巧 华北 制药集 团 新药研究
生物 杖 术 通 报 ? 研 究报告 ? 丑了 百 口 厅 口乙口 年增刊 重 组 单 抗 药 物 的肤 图 分 析 魏敬双 程立均 刘进怀 , 贾茜 巧 华北 制药集 团 新药研究 开 发 有 限责任公 司 石 家庄 摘 要 , 建 立 了 重 组 单抗 药物 的 肤 图分 析 方 法 。 。 在 变 性 条件 下 向抗 体 溶 液加 入 还 原 剂 打 开抗 体 内部 所 有 , , 交联 的 二 硫键 再加 入烷 基 化 试 剂 封 闭 所 有 的 自由筑 基 使 抗 体 分 子 在 溶 液 中以 游 离伸展 肤链 的 形 式存 在 。 加入 胰蛋 白 酶 将 充 分 伸展 的 肤 链 酶 解成 小 的 肤段 , 用 反 相 高效 液 相 色谱 层 析 分 析 肤 图谱 , 。 对连 续 , 批 中试 产 品 及 理 化 测 定 对 照 品 进行肤 图分 析 各 样 品 均 能 酶 解 完 全 批 间肤 图谱 一 致 , 。 该 方 法 实 用 有效 适 于 进行 重 组 单抗 等 结 构 复 杂的 大 分 子 蛋 白 药物 的 肤 图检 查 分 析 关键 词 重 组 单抗 。 肤图 抗 狂 犬 病 毒单抗 胰蛋 白酶 反相 八 翻 刀门 召 心 , 材 以 , 访 , 理 双 珍 , 铭 , 班 , , 卿 脚 叮 盯 呷 叫, , 一 即 氏 一 口 对 于 重 组 蛋 白质 药物 的 肤 图 检 查 我 国 药典 川 , , 是采用 基 因工 程 手 。 中收 录 了两 种 方 法 分 别 为胰 蛋 白酶 裂 解 , 一 反相高 段 用 , , 中 国仓 鼠卵 巢 工 程 细胞表 达 的全人 源 , 效液 相色 谱 法 和 嗅化氰 裂解 法 用更 为广 泛 , , 。 其 中第 一 种方 法 应 一 亚 型 抗 体 用 于 狂 犬 病毒暴 露 后 预 防 , 在产 品 。 。 但 是 对 于 重 组 单 克 隆抗 体 产 品 的 肤 反相 。 , 研 发 过 程 中 对 重组 抗 体 的肤 图 检 查 法 进 行 了 实验 图检 查 如 果 使 用 药 典 中 的 胰 酶 裂 解 摸索 确 定 了 使抗 体产 品 酶解 完 全 的 实 验 方 法 分析方 法 几 乎 得 不 到裂 解 峰 图 , , 这 是 因 为抗 , 材 料 与方 法 主 要试 剂 与仪 器 体 分 子 结 构 复杂 由 四 条肤链 组 成 链 间及链 内 由多 对 二 硫键相联 , 。 即 使 肤链 被 胰 酶 切 开 但仍 被 二 硫 。 为 碘 乙 酞胺 , 脚 公 司产 品 , 盐 酸肌 。 , 键联在 一 起 无 法 分成 独 立 的肤 段 重 组人 源 抗 狂 犬 病毒单 抗 基金项 目 “ 二 硫 苏糖 醇 均为分析纯 试 剂 一 十一 五 ” 计 划 生 物 和 医 药技术领域 重 大项 目基 金 资助 一 作者 简 介 魏敬 双 , 女 高级 工程 师 从 事生 物技术药物研究 开 发 工 作 , , 年增刊 ,二了 乙‘ ,｝ ‘ 山 魏敬 双 等 重组 单抗 药物 的肤 图分析 … 侧 二 口乃 刀 刀 刀 刀 , 刀 刀 刀 刀 刀 刀 刀 刀 图 用 现 行 药典方法得 到 的重 组 人 源 抗狂犬病 毒单抗原 液 的肚 图 重组 人 源 抗狂犬病毒单抗 原液 , , 批 号 反相 分析 将终止反应 的样 品管 , 及 理 化 测 定对 照 品 岁 。 , , 离心 液相 色 谱仪 流 动相 。 精 密量 取 上 清 液 闪 注人 批号 , 浓度 约 由华 北 制药集 , 以 三 氟 乙 酸 的 水溶 液为 团 新 药研究 开 发有 限 责任 公 司 试制 液 以 。 , 的 乙 睛 溶液 为 流 动 相 超 滤离 心 管 截 流 量 心 管 截 流量 , 超滤离 。 液 。 流速 为 至 梯度洗 脱 至 , 液从 。 。 液从 检 测 波长 台式 高速 冷冻离 心 机 林 , 一 结果 对 连续 巧 泵 , 一 柱为 批 中试规 模制备 的重 组 人 源 抗 狂 犬病 , , 公 司产 品 。 毒单抗原 液样 品及 理 化 测 定 对 照 品进 行 肤 图 分 析 公 司产 品 叮 高压 液相 色 谱 仪 为 检测 器 方法 , 各 批 样 品 图形 一 致 结 果 见 图 。 作站 。 讨论 生 物 工 程 产 品 的质 量 控制 是 保 障产 品 质 量 的关 抗 体蛋 白的充分 变 性 取 重组 人 源 抗 狂 犬病 毒单抗 原 液 或 理 化 测 定 对 照 品 为 含 林 , 键 其 中肤 图是 研 究 蛋 白质 一 级 结 构 的 一 种 重 要 的 , 闪 移人 截 流量 , 分析方 法 。 对 重 组 蛋 白质药 物来 说 肤 图 分析 可 作 , , , 的超 滤离 心 管 盐酸肌的 混 匀 后 移人 。 , 离心 管中 。 , 加人 为 与 天 然产 品 或 参 考 品 作 精 密 比 较 的 手 段 可 以 鉴 碳酸氢铰溶液 别 蛋 白质 的翻 译 后 修 饰 其 次 可 以 用 作 产 品批 间 同 一 性 的 检 测 手段 早在 , 。 二硫键 还 原及 烷基化 保 护 按 文献 叫 介 绍 的 方法 进 行 年 , ’ 等就 通 过 肤 图 谱 分 析 的 批 准 上 市 的 治疗 性 大 致 过 程 为 向上 述 样 品 管 中加 入 二 硫 苏糖 醇 溶 液 手段 鉴 别 出 了 第 一 个 获得 闪 混匀后 于 , , ℃ 单抗 , 玲 的 降解 位点 , 。 水浴 。 加人 碘 乙 酞胺溶 液 。 闪 混 匀后 目前 重 组 单抗 药物 已 经 成为 生 物技术制药 的开 于室 温 避 光放置 发 热点 我 国也 已 有多个单抗产 品 获 得 生 产 批 文 , 。 作 。 胰 蛋 白酶 裂 解 将 上 述 反 应 溶液移 人 截 流量 为 的超 滤 离 心 管 岁 ℃水 浴 , 为重组 蛋 白质 药物质量控制 的一项重 要 内容 关 于 单 离心 , , , 加人 抗 的肤 图分析方 法 值得 我 们进行认真 的 实 验摸 索 , , 碳 酸氢 铁 溶 液 有胰 蛋 白酶 溶 液 管中 于 止反应 。 , , 闪 混 匀后 移人 一 装 序列 分 析 纯 ℃放 置 对 于 含有 多 对 二 硫键 的 结构 复 杂 的 大分 子 蛋 白 闪的 以终 质 为 了 得 到酶解 完 全 的 肤 段 首 先 需 要 将 所 有 二 硫 键 进行 还 原 处理 使 二 硫 键 断 裂 成 为 还 原 状 态 的 自 由琉 基 。 , 为 防 止 自由琉 基 再 次 形 成 二 硫 键 可 采 用 , 生物 杖 术 通 报 舒 原 。 年增 刊 , 烷 基 化封 闭 的手 段 酶裂 解 。 。 通 过 上 述 处 理 蛋 白质 分 子 在 , , , 溶 液 中成 为彼 此 游 离 的 伸 展 肤 链 适 于 进 行 胰 蛋 白 对 于 含有 大 量 二 硫键 的蛋 白质 溶 液 中必 卜一 一 ? 关于 所需 还 原 剂 和烷基 化试剂 的用量 【 〕 的量 比 二 硫 键 的 总 量 推荐 的 剂 量 是 ‘ , , 多 而 碘 乙 酞 胺 的量 则 要 比 溶液 中琉 基 的总 摩 须有足 够 的 还 原 剂 才 能 使 所 有 二 硫 键 得 到 充 分 还 一 ’ 尔数 富余 倍 。 」, 住川 , ‘注, — , ’ ‘ 。 刀, ‘‘ 「 。 「 」 。 , 「 【 盯 冈 ‘ 咧 甘叼 丫叼 口 一 , , “ ‘ “ 曰‘ 曰 占 ‘ ‘ ‘ 曰 ‘ 洲〕 巧 ‘ 一‘ 一 司 刁 一“ 一 刀 刀 , 。’ ” 「 , ‘ ” ’ 。 二 二 , 力 贬 ’’ ‘‘ 兀 喇 呱如 甲叨 匕 ‘ ‘二 ‘司 山曰‘ 上 一‘ 刀 刀 刀 乃 ｝ 一 〕 刀 力 刀 刀 一 户 刀 刀 刀 哪 姗 即 岌 一 一 伴 ? 刀 刀 力 刀 刀 重 组 人 源 抗 狂 犬病 毒单 抗 原 液 样 品 及 理化 测定 对 照 品 的肤 图 年增刊 魏敬 双 等 重 组 单抗药物 的肤 图分析 , 为从 重 组 单 抗 的 肤 图 谱 得 到更 多 的 信 息 ’ 等 还 曾尝试 过 先将 重 组 抗 体 的 轻 链 重 链 分 开 、 不 需 额外 的仪器设 备 却 可 以 大大缩 短 实验 的 时 间 , , , 同时也 避 免 了频繁更 换 透 析液 的 繁琐 操 作 , 。 分别进 行蛋 白酶 裂 解 之 后 进 行 用 这 种方 法 鉴 别 出 了 一 种 单 抗 发 生 交 联 变异 的情 况 。 , 一 分析 。 利 、 除重 组 单抗 药 物外 其它 一 些 分 子 量 大 结构复 杂 二 硫键 含 量 高 的 重 组 蛋 白药 物 如 我 公 司 在 研 的重组 人 血 白蛋 白 每分 子 含 , 、 的重 链 , 对 二 硫键 的 肤 图 。 在对 抗 体样 品 进 行 变 性 及 胰蛋 白酶 裂解 前 均 需将 抗 体样 品的缓 冲液 置 换 为适 于 进 行 下 一 步操作 的环 境 中 常规的换 液方式是 采 用 透 析法 透 析换液 的过 程 非 常耗时 一 般 需 要 透 析 几 个小时 而且 在 透 , , , , 谱分析 都 可 以 适用 于 本研究所 建 立 的 方 法 参 考 文 献 国家药典委员会 中华 人 民 共 和 国 药典 , , 年版 部 北 析 过 程 中 常常伴 随着样 品 的稀 释 透 析换液 后 样 品 浓度 降低 , , , 京 化学工 业 出版社 , 附录 一 。 本试验 中 所 有 的 换 液 操作 通 过 超 滤离 , , , , , 一 心 完 成 使用 超滤离 心 管 可 以 在 很 短 的 时 间 内完 成 一 , 习 滋 , 换液 操作 同时 样 品还 可 以 很 方便 地 浓 缩 到所需 要 , , , 一 的浓度 段 。 。 所 以 只 要选 择好合适 的 截 流量 使 用超 滤 , , , 盯 , , 一 离 心 管进 行 换 液操作是代替 透 析法 的非常实用 的手 鉴 于 台式高速 离 心 机 在 一 般 的分析检 测 实验 室 , , , , 司 一 , 群 , 已 经 属 于 常规 仪器 所 以 用 超 滤离 心 代 替 透 析 法 并 上接 第 页 , , , , 选 和 检测 更多中风 相关 多态性 位点是 我 们 研 究 的下 一 步 目标 卿 〕 将寡核 昔 酸 芯 片 用 于 疾 病与 , , 苏净 谭兰 国外 医 学 脑 血 管疾病 分册 肠 , , 一 , , 。 的 肠 , , , 一 关联 分 析 这 个 思 路 是可 行 的 芯 片 的高通 量 平行 性 的特 点 将 会 对 多 基 因 遗 传病 的 分 子 病 理 机 制 的 研 , 张颖冬 等 中风 与神 经 疾病杂 志 , , 一 赵勇 等 中华 老年 心 血 管病杂志 , , , , 一 究 和 易感 基 因 的检 测 及 个性 化 治疗 起 到 较大 的推动 , 一 作用 。 , , 一 , , , , 一 参 考 文 献 , , , 口 罗 , , 一 洲 , 一 , , , , 一 , , 习 , , 一 , , 一 , , , 王 先梅 等 国外 医 学 脑 血 管疾 病分册 , , , , 一 《 刃 , 一 一 , 一 , , 一 李瑶 主 编 基 因 芯 片 技术 解 码 生 命 北 京 化 学 工 业 出 版 社 《 叉 , 一 , , , 又 , 一 一 , 一 , , 】 , , , 张 晨 等 中华 老 年 心 血 管病 杂 志 , , , , 一 住 盯 , 城 , , 一 印 , , , 一 王 忠 刘 建勋 王 永 炎 , , , 中 国 药理学 通 报 , , 一 , 加 , 一
