铁皮石斛为兰科植物Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥茎，自1963年《中国药典》就有收载铁皮石斛。铁皮石斛在民间素有“救命仙草”之称，具有“滋阴清热，益胃生津”之功效，成书于1 000 多年前的《道藏》尊其为“中华九大仙草”之首。在2012年，根据《食品安全法》和《新资源食品管理办法》的规定，经新资源食品评审专家委员会审核，拟批准铁皮石斛原球茎为新资源食品。
酵素是“酶(Enzyme)”的旧称，在生物体内以催化剂的形式发挥作用。目前酵素分为广义的酵素(Ferments)和狭义的酵素。广义酵素强调微生态整体。而与酶同义的酵素可认为是狭义的酵素。我国有利用天然药材的传统习俗含有酵素药材，如麦芽、鸡内金、神曲等。
针对现有技术的不足，本发明提供了一种铁皮石斛酵素的制备方法及应用，它简单易行，且获得的产品具有良好的抗氧化效用。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：铁皮石斛酵素的制备方法，将铁皮石斛原料洗净后切成段，将切好的铁皮石斛段加入水及红糖，充分混合均匀后，在室温下密封放置50-80天，期间每隔10天放气一次；发酵时间结束后，将发酵液进行过滤，取滤液获得铁皮石斛酵素。
所述的切好的铁皮石斛段与水的料液比为30:100，单位是g/ml；切好的铁皮石斛段与红糖的质量比为3:2。
本发明具备以下有益效果：本发明采用简易的发酵方式来制备铁皮石斛酵素，其制备方法简单易行，适合于批量生产，并且申请人还发现，所获得的铁皮石斛酵素具有良好的抗抗氧化效用，适合将其应用在抗氧化食品的制备。
本发明的实施例：铁皮石斛酵素的制备方法，将铁皮石斛原料洗净后切成段，将切好的铁皮石斛段加入水及红糖，切好的铁皮石斛段与水的料液比为30:100，单位是g/ml；切好的铁皮石斛段与红糖的质量比为3:2，充分混合均匀后，在室温下密封放置50-80天，期间每隔10天放气一次；发酵时间结束后，将发酵液进行过滤，取滤液获得铁皮石斛酵素。
铁皮石斛鲜品由贵州涵龙生物科技有限公司提供，经贵阳中医学院魏生华鉴定为兰科植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的干燥茎。
上水井红糖重庆九区食品厂；1，1-二苯基苦基苯肼(1， 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，2，4，6-三吡啶基三嗪 (TPTZ)，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，维生素C(L-抗坏血酸)均购于Sigma公司；三氯化铁，硫酸亚铁，甲醇，无水乙醇，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，可溶性淀粉，酚酞，过硫酸钾均为国产分析纯；自制蒸馏水；玉米油购于北京艾森绿宝油脂有限公司。
UV-2300紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司， TAISITE恒温水浴锅天津泰斯特仪器有限公司，CJJ78-1磁力搅拌器上海垒固仪器有限公司；S433D全自动氨基酸分析仪赛卡姆(北京)科学仪器有限公司；TTL-DCII氮吹仪同泰联科技有限公司。
铁皮石斛原料→洗净→切段→取30g铁皮石斛放入瓶子→加入100mL水及10g红糖→密封置室温条件下存放→每隔10天放气一次→2个月后过滤→紫外照射2h中止发酵[6-9]。
吸取酒样200μL于10mL玻璃管中，用氮吹仪吹至全干，用2mL 样品稀释液复溶，上机待测。
采用FRAP法，在试管中分别精密2mL样品溶液和2mLTPTZ工作液，,混匀后，25℃避光反应10min，在593nm下测定吸光度[11-13]，以VC做阳性对照。以FeSO4为标准物质绘制标准曲线)，求得回归方程为Y＝5.298X+0.0679，相关系数为R2＝0.9996，样品的抗氧化能力以FRAP值表示:1FRAP单位＝1mmol/L FeSO4，即样品的抗氧化能力相当于Fe SO4的mmol/L数。
准确称取19.7mg DPPH，用甲醇溶解，定容到50mL,即得DPPH 储备液，于4℃下保存。实验前移15mL DPPH储备液，用甲醇定容到100mL，制成浓度为0.15mmol·L-1的工作液。
在试管中加入3.2mL0.15mmol·L-1的DPPH溶液，再加0.8mL样品溶液，将其混匀后，25℃避光反应30min，于517nm波长下测定吸光度，VC作为阳性对照[14-15]。测吸光度，按式(1)计算DPPH自由基的清除率(％)。
精密称定0.3841g ABTS和0.0662g K2S2O8于烧杯中，并用蒸馏水定容至100mL，使得ABTS的终浓度为7mmol·L-1，过硫酸钾的终浓度为2.45mmol·L-1。将混合液在常温下暗处放置12-16h，实验前用甲醇稀释，使其在734nm波长下吸光度为0.8左右的ABTS+·工作液。
以VC为阳性对照，向试管中加入3mLABTS+·工作液，再加入 0.3mL不同浓度样品溶液，将其混匀后，25℃避光反应10min，在 732nm波长处测定样品的吸光度.按式(2)计算ABTS自由基的清除率(％)。
称取4g聚乙烯醇溶于196ml热水中，配置成2％的聚乙烯(PVA) 溶液，再将150mLPVA溶液和50ml玉米油混合，于磁力搅拌器上搅拌30min制成油脂混悬液；称取1.5g磷酸二氢钾及2.4g磷酸氢二钠配置成100ml的磷酸缓冲溶液，调pH至7.5；称取2gNaOH溶于100mL 水中，配置成0.05mol/L的标准溶液；称取1g酚酞溶于100mL95％乙醇中配成10g/L的酚酞指示剂。
取三个150mL锥形瓶，分别标注为空白瓶(A)、测定瓶(B、C)，分别加入4mL油脂混悬液及5mL磷酸缓冲液，A瓶加入15mL95％乙醇，将三个瓶放在水浴锅上37℃恒温5min，再往向三个瓶子里分别加入1mL酵素原液，混匀，37℃恒温10min后，在B、C瓶里加入15mL的95％乙醇。分别向A、B、C三个瓶子里加入3滴酚酞指示剂，用NaOH标准液滴定。按式(4)进行计算其内脂肪酶活力X: X＝(B-A)×c/0.05×50×1/15×n＝200/3×(B-A)×c×n
式中：X为样品的酶活力，U/g；B为滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；A为滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积， mL；n为稀释倍数；C为氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；0.05为氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；
铁皮石斛氨基酸成分分析结果如表2，该酵素液含有除色氨酸以外的赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸等8种人体必须氨基酸，且胱氨酸、磷酸丝氨酸、酪氨酸和肌肽含量较高。
经查阅文献可知，牛肉的肌肽含量约为0.0135mg/g[22]，且由于通常肉类食物中存在的肌肽较多，但铁皮石斛酵素的肌肽含量 (0.023mg/g)高于牛肉所含肌肽量，肌肽是一种对抗衰老起着很大作用的一种化合物质，且是美白的优选添加物。以此为出发点，铁皮石斛酵素的抗氧化活性以及在美白方面的应用是值得探究的，铁皮石斛酵素里含有几乎全部的必须氨基酸。人体必须氨基酸摄入缺乏，可以考虑对铁皮石斛酵素作进一步探究。
由图可知，以FRAP值为纵坐标，以VC和铁皮石斛酵素浓度为横坐标，FRAP与铁皮石斛酵素及VC浓度呈良好的线性关系，且得到铁皮石斛酵素总抗氧化能力的公式为 Y＝0.0692X-0.0065,R＝0.9993；VC总抗氧化能力的公式为 Y＝5.7205X-0.0146,R＝0.9989[23]。由公式可得1mL1％的酵素的总抗氧化能力与1mL0.0135mmol/L的VC的总抗氧化能力相当。
铁皮石斛酵素与VC对DPPH自由基清除率以DPPH自由基清除率为纵坐标，以铁皮石斛酵素及VC浓度为横坐标，可知DHHP抑制率与铁皮石斛酵素及VC浓度呈良好的线性关系，且得到铁皮石斛酵清除DPPH自由基的方程Y＝2.8288X-7.5891,R＝0.991，及VC清除 DPPH自由基的方程Y＝332.94X+10.222,R＝0.9714。1mL的10％的铁皮石斛酵素清除DPPH自由基的能力与1mL0.0315mmol/L的VC的清除DPPH自由基能力相当。
