大家好，今天同大家分享一篇发表于Science Advances期刊题为 “An artificial metalloenzyme for catalytic cancer-specific DNA cleavage and operando imaging” 的文章。该工作利用精准构筑的人工金属酶作为生物分析探针，建立了原位动态监测肿瘤治疗效果的分析新方法。本文通讯作者是北京工业大学高学云教授和中国科学院高能物理研究所赵丽娜研究员。本文第一作者是北京工业大学高靓副教授和硕士研究生张雅。
多功能时空分辨分子影像技术拓展了人类对关键生命活动的认知，加深了对生理或病理进程的了解。其中，化学发光成像技术是一种高灵敏、简便和低成本的分析方法。追踪化学发光信号可在分子、细胞甚至活体水平上实时监测重要生命过程，特别有助于可视化评估重大疾病治疗效果。实现活体化学发光成像的关键和挑战之一是合理设计与精准构建长寿命化学发光生物探针。
天然金属酶多以金属团簇作为辅因子，为精准设计适用于成像分析的人工金属酶探针提供了重要启发。该研究团队以肿瘤靶向肽修饰血清白蛋白，利用一步仿生策略，在其内部空腔精确构筑了活性中心为铜团簇的人工金属酶探针分子。研究发现，该探针分子具有与底物匹配的能级和恰当的几何构型，可长期、稳定、选择性催化肿瘤微环境中过表达的过氧化氢并高效将其转化为羟基自由基和氧气。产生的羟基自由基可持续氧化底物产生灵敏化学发光，适用于活体水平上实时动态跟踪肿瘤治疗效果。该工作利用金属团簇独特而稳定的类酶催化活性，不仅长效切割肿瘤细胞DNA，并且在肿瘤微环境中持续催化产生化学发光，为长期灵敏可视化监测肿瘤氧化损伤治疗效果提供了新的动态分析方法。
图1. 精准构建人工金属酶用于持续切割肿瘤细胞DNA及实时动态监测抗肿瘤治疗效果。
图2. （A）BSA和BSA-CuCs的MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）图。（B）RGD-BSA和RGD-BSA-CuCs的MALDI-TOF MS图。（C）BSA-CuCs和RGD-BSA-CuCs的激发和发射荧光光谱图。（D） BSA、BSA-CuCs和RGD-BSA-CuCs的紫外-可见吸收光谱。（E）RGD-BSA-CuCs的代表性组成结构图（左图），分子对接计算的Cu13团簇在RGD-BSA中的嵌合位置图（中间），以及用DFT（密度泛函理论）计算的优化的Cu13团簇构型图（右图）。（F）采用TDDFT计算具有D2h对称性的Cu13团簇的摩尔吸收系数。（G）RGD-BSA-CuCs的导带（CB）和价带（VB）相对于H2O2相关的氧化还原电对的电极电势的位置。左竖线依据标准氢电极水平，右竖线依据真空能级水平。
图4. （A）在pH 6.5和pH 7.4，12 μM RGD-BSA-CuCs与100 μM H2O2在37 ℃混合24 h前后的HRTEM（高分辨率透射电镜）图。（B）在pH 6.5（上图）和pH 7.4（下图），在HRTEM图上随机对50个纳米晶进行粒度统计分析。（C）在37℃，两种pH条件下， RGD-BSA-CuCs在催化过程中的相对荧光强度（Ft/F0）随时间的演化。（D）在37℃，两种pH条件下，RGD-BSA-CuCs的Cu-K边在催化前，催化24小时后的归一化XANES图。（E）DFT计算从最初的Cu13到中间化合物Cu13=O的反应途径。（F）DFT计算从中间化合物Cu13=O到初始Cu13的反应途径。
图5.（A）相同剂量的RGD-BSA-CuCs、BSA-CuCs与A549肺癌细胞分别孵育48 h后的细胞体外存活率。以RGD-BSA处理的A549细胞为对照组。（B）系列剂量的RGD-BSA-CuCs处理A549细胞48 h后，细胞内ROS的产生图。（C）系列剂量的RGD-BSA-CuCs诱导A549细胞凋亡比例。（D）系列浓度RGD-BSA-CuCs，100 μM H2O2与超螺旋pUC19质粒DNA在37℃混合12 h后的琼脂糖凝胶电泳图谱（左图）。9.6 μM RGD-BSA-CuCs与100 μM H2O2混合后，在12 h内持续切割质粒DNA（右图）。（E）彗星实验研究人工金属酶的浓度依赖的DNA损伤（左图）及彗星尾DNA含量统计分析（右图）。（F）皮下异种移植肿瘤模型的建立及治疗方案示意图。（G）给药21天的皮下异种移植肿瘤的生长曲线天后肿瘤生长受到显著抑制。（I） 肿瘤解剖组织的典型H&E和TUNEL染色图。
图6. （A）系列浓度的RGD-BSA-CuCs和100 μM H2O2混合，产生•OH氧化1.0 mM底物L-012产生的化学发光图（左图）和信号强度（右图）。（B）系列浓度的H2O2和12 μM RGD-BSA-CuCs混合，产生的•OH氧化1.0 mM的底物L-012的化学发光图（左图）和信号强度（右图）。（C）100 μM H2O2和9.6 μM RGD-BSA-CuCs混合，产生的•OH氧化1.0 mM L-012随时间变化的化学发光图（左图）和信号强度（右图）。（D）腹腔注射RGD-BSA-CuCs后1, 2, 4, 6, 12与24 h, 小鼠于瘤内注射L-012底物的化学发光图。每组左侧的小鼠是生理盐水处理组；中间小鼠是仅注射L-012底物的小鼠组；右侧小鼠是人工金属酶与底物同时注射组。与仅用L-012或生理盐水处理的小鼠相比，同时注射CuCs和L-012的小鼠肿瘤区域呈现更高强度的化学发光信号。（E）肿瘤区域在指定时间的相应化学发光强度。（F）利用化学发光评估小鼠给药治疗7、14和21天后的肿瘤部位的催化治疗效果。（G）肿瘤区域在指定时间的相应化学发光强度。
科研人员结合理论计算模拟，通过定量实验研究，阐明了该人工金属酶的精细分子结构和能级分布特征，进一步揭示其类酶催化活性机制。利用金属团簇本征的量子尺寸效应，调控能带相对位置，赋予其特异性催化能力。特别需要指出的是，随着催化反应的进行，团簇的金属价态发生封闭式周期性循环，确保活性中心不被损耗，从而保证了催化反应的稳定性与持续性。该工作从结构和功能的角度模拟天然酶，为精准按需合成生物相容性人工金属酶提供了重要指导。同时，该工作利用金属团簇独特的催化动力学和稳定性以提供新的生化反应路径，为可视化监测和高效对抗特定肿瘤提供了新方法。
原标题：《【科技前沿】基于人工金属酶的原位动态观测肿瘤治疗效果的分析方法》
